抗原修復法（Antigen Retrieval，AR）

  福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好的進行反應。在免疫組化染色后的鏡下觀察中，有發現這樣的結果，陽性物反應不強，時隱時現，表達不均勻，有時可出現假陰性。為了解決上述存在的問題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來，目前世界上公認的方法就是必須進行抗原修復。抗原修復（Antigen Retrieval，AR）是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程。抗原修復能最大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果，成為一種有效的補救措施。

        至今為止，抗原修復有許多種方法，在這些方法中，有的是根據抗體的要求來進行，有的是根據抗原的表達程度來進行。抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。

（一）抗原熱修復法

抗原熱修復是以高溫、高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。

1. 微波熱修復

切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘阻斷內源性過氧(化)物酶，用蒸餾水沖洗。在微波爐里加熱抗原修復液（如0.01M，pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液）至沸騰。將組織切片置于切片架中，放入已沸騰緩沖液中，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次加熱后，取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。從緩沖液中取出切片，經蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘，然后進行IHC染色。

2. 高壓熱修復

將玻片置于金屬染色架上，連同修復緩沖液放入高壓鍋內，使切片位于液面以下，蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。加熱至產生噴氣，并持續2min，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。加熱長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鐘，時間過長可能會使染色背景加深。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

3. 煮沸熱修復

切片脫蠟至水后，放入盛有修復緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

（二）酶修復

非加熱抗原修復技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修復抗原。對某些細胞內抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。

a.胰蛋白酶消化法：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml 0.05％或0.1％ PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可；使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘。

b.胃蛋白酶消化法：用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；消化時間37℃ 30～180min。

c.鏈霉蛋白酶消化法：將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/L pH7.4的Tris-HCL中，濃度為0.1％，消化時間37℃ 1～4h。
d.蛋白酶K消化法：用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制成20μg/ml的蛋白酶K，，消化時間37℃ 20～40min。

e.無花果蛋白酶消化法：0.1%濃度，用0.2M pH7.4 PBS配制，消化時間37℃ 30～60min。

f.菠蘿蛋白酶消化法：其濃度為0.4%～1％，溶在0.01M，pH7.4 PBS中，37℃消化30～120min。g.尿素消化法：濃度3M，37℃消化5～30min。

胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶主要用于細胞間質抗原的檢測前消化，其余蛋白酶均為細胞內抗原的顯示消化。在配制和使用時應考慮到酶激活的最佳pH值，消化溫度、濃度和孵育時間。