真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在（Figure1）。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation ,簡稱ChIP) 是一種在體內(nèi)研究DNA 和蛋白質(zhì)相互作用的方法，在過去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。

Figure 1: 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

     染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是 ：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,超聲波將染色質(zhì)打碎后,用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息（Figure 2）。

1. 1 　細胞的甲醛固定

甲醛(formaldehyde) 是一種高分辨率(2 A) 的可逆的交聯(lián)劑,能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA ,蛋白質(zhì)-RNA 交聯(lián)。其原理為： 在甲醛的作用下，DNA 堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的α氨基及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA 和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起,在幾分鐘內(nèi)形成生物復(fù)合體( biopolymers) ，防止細胞內(nèi)組分的重新分布；而且,甲醛并不作用于游離的雙鏈DNA ，從而避免DNA 的損傷。特別是,甲醛交聯(lián)反應(yīng)是完全可逆的,便于在后續(xù)步驟中分別對DNA 和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1 % ，而交聯(lián)時間需要預(yù)實驗來確定。這是因為：交聯(lián)時間過長，則實驗材料易丟失，且交聯(lián)后的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體難以用超聲打斷;交聯(lián)時間過短， 則交聯(lián)不完全。通常的交聯(lián)時間為5 min～1 h ，可以隨時加入甘氨酸來終止交聯(lián)反應(yīng)。

1. 2 　超聲波斷裂染色質(zhì)

Figure2: 染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）方法程序

甲醛交聯(lián)后的染色質(zhì)對限制酶和DNase I 高度抵抗,因此通常使用機械剪切力使得染色質(zhì)斷裂。打斷后的染色質(zhì)片段的平均長度應(yīng)該在500～1 000bp 左右(可以用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定) 。染色質(zhì)片段的平均長度對于蛋白質(zhì)在DNA 上結(jié)合位點的高分辨率作圖非常重要。

1. 3 　染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化

用目的蛋白特異性的抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀�？贵w的量要進行優(yōu)化,防止非特異的結(jié)合。用Protein A/ G Agarose/ Sepharose 回收免疫沉淀復(fù)合體。經(jīng)過洗滌除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用1 %SDS + NaHCO3 洗脫免疫沉淀復(fù)合體。

1. 4 　交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA 的純化

在免疫沉淀復(fù)合體中加入不含DNase 的RNase 和Proteinase K(也可以不加蛋白酶K，交聯(lián)逆轉(zhuǎn)后用QIAquick DNA cleanup system 回收DNA ,蛋白還可用于做進一步的析) ，65 ℃保溫 6 h 使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。純化的DNA 極少，可用色譜定量。

1. 5 　染色質(zhì)免疫沉淀的DNA 的分析和蛋白質(zhì)在DNA 上結(jié)合位點的鑒定

染色質(zhì)免疫沉淀的DNA 的分析方法有許多種。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狹縫雜交和PCR 分析；如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的( high throughput ) 研究目的蛋白在基因組上的分布情況，找出反式作用因子的結(jié)合位點，可以采用Sout hern 雜交、ChIP 克隆和DNA芯片方法。

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